La pinacoteca nazionale è allestita dal 1932 nel Palazzo Buonsignori, edificio tardogotico della seconda metà del XV secolo. Iniziata dall’abate Giuseppe Ciaccheri alla fine del XVIII secolo, la collezione divenne proprietà statale nel 1930 e nel 1977 accolse la collezione Spannocchi, costituita da dipinti di maestri nordici e fiamminghi. Nello stesso anno, nel palazzo venne inaugurata la Sala delle Sculture, con opere di maestri senesi del XIV–XV secolo.
Il museo è ripartito su tre piani. Al pianoterra si conserva una piccola raccolta di sculture, cartoni, disegni e depositi. Al primo piano artisti della seconda metà del XV secolo e dei secoli seguenti. Al secondo piano, forse la parte più interessante, artista senesi del Trecento e Quattrocento, come Duccio di Buoninsegna, Simone Martini, i fratelli Lorenzetti, il Sodomia, il Beccafumi.